شاخه­ های به دست آمده از مرحله دوم، در این مرحله برای تکمیل فرایند ریز ازدیادی باید ریشه­دار شوند. بیشتر گیاهان در مرحله ریشه دهی نیاز به محیط کشتی با نصف عناصر ماکرو دارند. در این مرحله معمولا از تنظیم کننده­ های رشد متفاوت از مرحله پرآوری استفاده می­ شود. برای موفقیت مرحله سازگاری و انتقال به خاک ، گیاهچه­های دارای ساختمان ریشه مناسب و قوی ضروری است. این مرحله نیاز به کار زیاد دارد و غالبا گران است. بطوری که محاسبه شده که حدود ۳۵ تا ۷۵ % از کل هزینه­ های تولید را شامل می­ شود.(جورج، ۱۹۹۳)

مرحله ۴: مرحله سازگاری به شرایط طبیعی
این مرحله آخرین مرحله از کشت درون شیشه ای است که نمونه­های تکثیر شده برای انتقال به گلخانه آماده می­شوند. نمونه­های تکثیر شده در شرایط درون شیشه ­ای ، تمایل به رشد انفرادی و انجام عمل فتوسنتز دارند. نمونه­ها به تدریج از شرایطی با رطوبت زیاد به رطوبت کم و از شدت نور به شدت نور زیاد و دمای محیطی متغیر منتقل می­شوند. اگر نمونه­ها در محیط کشت جامد باشند، قبل از انتقال باید آگار چسبیده به اندام­های گیاهچه به آرامی توسط آب شسته شود و سپس در خاک مناسب در گلدان­های کوچک کشت شوند. نمونه­ها به تدریج می­توانند بعد از ۳ تا ۶ روز به محیط جدید با شرایط نوری طبیعی وارد شوند و بعد از آن گیاهان به مخلوط ماسه، پیت و یا کمپوست منتقل می­شوند و به تدریج سازگار می­گردند. آبیاری مرتب نمونه­ها (روزهای اول انتقال به خاک با نصف غلظت محیط کشت) و مبارزه با عوامل بیماری زا و آفات از ضروریات انتقال موفق است (جورج، ۱۹۹۳؛.اهلووالا^[۳۰]، ۲۰۰۲).
۱-۱۵- انواع ترکیبات محیط کشت
برای انجام موفقیت آمیز کشت بافت لازم است که یک محیط متناسب با رشد گیاه با توجه به نیازهای روزانه آن که عاری از هر گونه آلودگی است تهیه گردد. برای این کار لازم است پژوهشگر با انواع نیازهای یک گیاه آشنایی داشته و بتواند این مواد را با هم ترکیب کرده و یک محیط عالی برای رشد نمونه خود آماده کند. به طور کلی مواد مورد استفاده در محیط­ها شامل مواد معدنی، ترکیبات آلی، مواد طبیعی و مواد کمکی می­باشد که در زیر به طور مختصر در مورد هر کدام توضیحاتی داده خواهد شد.
مواد معدنی
شامل دو گروه ماکروالمنت­ها (ازت ، فسفر ، پتاسیم ، کلسیم ، منیزیوم و گوگرد) و میکروالمنت­ها (مس، روی، آهن، منگنز، کبالت، بر و ید) می­باشد که به صورت نمک به محیط اضافه می شوند.
منبع هیدرات کربن
چون ریز نمونه­ها فاقد هیدرات کربن هستند و یا اگر کلروفیل هم داشته باشند، به علت تاریکی و کمبود دی اکسید کربن در محیط قادر به انجام فتوسنتز نیستند، لذا لازم است که ساکارز به عنوان منبع هیدرات کربن به محیط اضافه گردد. شکر از عوامل مهم و ضروری در هر محیط کشت غذایی می­باشد و برای رشد و نمو سلول­ها ، بافت­ها ، اندام-ها و گیاهچه­ها ضروری است. وقتی یک ریز نمونه روی محیط غذایی قرار داده می شود. در ابتدا رنگ سبز خود را از دست می دهد و بنابراین نمی­تواند غذای خود را فراهم کند چون قادر به فتوسنتز نیست. پس این سلول­ها باید به نحوی که با منبع خارجی انرژی کربنی، تغذیه شوند. ساکارز معمول ترین منبع انرژی کربن در کشت بافت است. به جز ساکارز ، منو ساکاریدهایی مثل گلوکز و فروکتوز که منابع قابل سوخت و ساز انرژی کربنی هستند می ­تواند به طور معنی­دار ، رشد سلول­های گیاهی را نسبت به ساکارز افزایش دهند. (پیری و نظریان ۱۳۸۰) .
۱-۱۶- ویتامین­ها
ویتامین­ها نقش کاتالیزوری داشته و در گیاهان سنتز می­شوند. در کشت بافت بسیاری از ویتامین­ها توسط
سلول­های در حال رشد و نمو سنتز می­شوند اما مقادیر ساخته شده کمتر از مقادیر مورد نیاز است. از این­رو لازم است ویتامین­های ضروری را به مقدار مورد نیاز به محیط کشت اضافه نمود. ویتامین­های گروه B مانند تیامین، اسید نیکوتینیک، پیریدوکسین، و میواینوزیتول نسبت به بقیه بیشتر مورد نیاز هستند. از بین آن­ها تیامین نقش مهمتری دارد )پیری و نظریان، ۱۳۸۰).
۱-۱۷- اسیدهای آمینه
اسیدهای آمینه و آمین­ها می توانند اهمیت زیادی در ریخت­زایی داشته باشند. تمام فرمول­های اسید آمینه، فرم­ های طبیعی موجود در گیاه هستند این مواد می­توانند شاخه­زایی یا ریشه­زایی را افزایش دهند. آمینواسیدها هنگام کاهش نیتروژن نقش خود را ایفا می­ کنند. در صورت ناکافی بودن نیتروژن، مکمل نیتروژن آلی کمپلکس مانند کازئین هیدرولیزات) ۵/۵گرم بر لیتر( ممکن است افزوده شود. سایر مکمل­های آلی عبارتند از شیر نارگیل، عصاره مخمر، پپتون و عصاره جو. هرچند محیط­های کشت سنتتیک ترجیح داده می­شوند و مکمل­های آلی که طبیعت شیمیایی ناشناخته دارند فقط در مواقع ضروری بکار می­روند) جورج و همکاران، ۲۰۰۸)^[۳۱] .
۱-۱۸- تنظیم کننده­ های رشد
هورمون­ها موادی هستند که در یک بخش گیاه ساخته شده و از خلال بافت­ها حرکت کرده تا به فعالیت سلول­ها در بخش دیگری تاثیر بگذارد برای مثال سایتوکنین ساخته شده در ریشه به ساقه منتقل شده و سبب رشد ساقه می­گردد. حال اگر رشد متوقف شود تحویل سایتوکنین کاهش یافته و رشد اندام­های هوایی کاهش می­یابد. این مقدمه اهمیت هورمون­ها را مشخص می­سازد ولی در کشت بافت هورمون­های زیر بیشتر مورد استفاده قرار می­گیرند. این گروه شامل اکسین طبیعی مثل ایندول استیک اسید (IAA)^[32] و اکسین های مصنوعی نظیر ایندول بوتریک اسید (IBA)^[33] ، نفتالین استیک اسید (NAA)^[34] هستند که اکسین های مصنوعی فعال تر از اکسین طبیعی هستند. همچنین اکسین های مصنوعی به وسیله آنزیم های موجود در بافت های گیاهی تجزیه نمی شوند. اکسین معمولا شروع ریشه دهی و رشد کالوس را تحریک می کند ولی رشد ریشه و جوانه های بالینی جلوگیری می کند ، سبب طویل شدن و رشد سلولی و تقسیم سلولی نیز می شوند. در غلظت بالا باعث رشد ریشه های نابجا می شود و در غلظت کم سبب تشکیل ساقه نابجا می شود. (اربنوا و همکاران^[۳۵]، ۲۰۰۲)
۱-۱۹- سایتوکنین :
کشف سایتوکنین­ها رابطه نزدیکی با کشت بافت دارد. در مرحله شروع کشت بافت گیاهی مشاهده شد که مالت، عصاره­های نارگیل و مخمر، رشد و القای جوانه­های درون شیشه ­ای را رونق می­بخشند (مشایخی، ۱۳۸۷). سایتوکنین­ها شامل سایتوکنین­های طبیعی ۲ip و زآتین و سایتوکنین مصنوعی نظیر بنزیل آمینو پورین (BAP ) و کینتین هستند. مزیت انواع مصنوعی این هورمون، فعالیت بیولوژیکی بالا و ارزان بودن آن­ها نسبت به انواع طبیعی است. این هورمون باعث تورم بافت­ها شده و ازدیاد شاخه و تقسیم سلولی را تحریک کرده ولی از شروع ریشه­دهی جلوگیری می­ کند. این هورمون در تحریک نمو جوانه­های جانبی از طریق کاهش غالبیت انتهایی بسیار اهمیت دارد. به علت پایدار بودن در برابر گرما این هورمون را می­توان قبل از اتوکلاو به محیط کشت اضافه کرد.(کرسا و همکاران^[۳۶]، ۲۰۱۲)
۱-۲۰- اسید جیبر لیک :
این گروه تاکنون بیش از ۱۰۰ ترکیب است که رایج ترین نوعی که در کشت بافت استفاده می شود ، GA₃ ^[۳۷] است. ناپایدار در برابر گرما است بنابراین بعد از اتو کلاو و از طریق فیلتراسیون ضد عفونی شده و به محیط افزوده می­ شود. کاربرد این هورمون نیز طویل شدن ساقه­ها و رشد طولی میانگره­ها است و از پدیده خواب جلوگیری کرده و آن را از بین می­برد. باید این نکته را یادآور شد که اگر میزان نسبت اکسین به سایتوکنین افزایش یابد ریشه زایی صورت می­گیرد و اگر این نسبت کاهش یابد سبب ساقه­زایی می­ شود و اگر بینابین باشد کال­زایی افزایش پیدا می کند (معینی و کهریزی ، ۱۳۸۲).
۱-۲۱- آگار و دیگر مواد تولید کننده ژل
آگار از رایج­ترین عوامل تولید ژل است که در محیط کشت استفاده می­ شود. آگار پلی ساکارید پیچیده­ای است که از برخی گونه­ های نوعی جلبک به دست می ­آید. غلظت مناسب آگار برای هر نوع محیط کشت و ریز نمونه باید تعیین شود. غلظت خیلی بالای آن منجر به تنش آب در محیط می­ شود و غلظت­های کم آن یک لایه مایع روی سطح ژله شده تشکیل خواهد داد و غرق شدن ریز نمونه در این لایه مایع مانع از مبادلات گازی شده و به کاهش رشد منجر می­ شود. به علاوه کشت ریز نمونه روی محیط کشت مایع می ­تواند باعث شیشه ­ای شدن کشت شود. تصور می­ شود آگار دارای توانایی جذب مواد است که این توانایی می ­تواند در حذف مواد زاید سلولی از محیط کشت به روش مشابه زغال فعال عمل نماید. هم­چنین این خاصیت می ­تواند مانع از جذب برخی مواد شیمیایی به بافت کشت شده شود. یکی از موادی که به شدت توسط آگار جذب می­ شود سیتوکینین است. بنابراین غلظت بیشتر آگار ، جذب سیتوکینین از محیط کشت را برای بافت مشکل می­ کند. متداول­ترین جایگزین آگار، ژل رایت است. این ماده یک پلی ساکارید پیچیده خارج سلولی است که توسط باکتری Pseudomonas elodea تولید می­ شود . ژل رایت نسبت به آگار دارای مواد معدنی آزاد و ناخالصی­های آلی کمتری است. البته دارای غلظت­های بالای پتاسیم و منیزیم می­باشد. تنها مشکل ژل رایت این است که بعضی از کشت­ها در ژل رایت سریع تر از آگار ، شیشه ­ای می­شوند. اغلب ژل رایت را همراه با آگار و با نصف غلظت­ های مورد نیاز هر کدام به کار می­برند. به این وسیله از مزایای هر دو ماده استفاده می­ شود و معایب آن­ها نیز کاهش می­یابد (باقری و همکاران ۱۳۸۳).
۱-۲۲- ترکیبات مورد استفاده در ضد عفونی مواد گیاهی
ضد عفونی یا استریلیزاسیون شیمیایی می ­تواند به روش­های مختلف انجام شود : (باقری و همکاران ۱۳۸۳ و باقری و صفاری ۱۳۷۶)
۱- الکل (اتانل): برای ضد عفونی مواد گیاهی از الکل ۷۰ درصد استفاده می­ شود ، زیرا الکل ۹۶ درصد باعث دهیدراته شدن بافت­ها می­ شود. از الکل ۹۶ درصد اغلب برای ضد عفونی ابزار و میز کار استفاده می­ شود.
۲- هیپوکلریت سدیم (وایتکس): دارای ۵ درصد ماده فعال است. معمولا از هیپوکلریت سدیم ۵/۲ درصد استفاده می شود. چنانچه گیاهان به هیپوکلریت سدیم حساس باشند از هیپوکلریت کلسیم برای ضد عفونی استفاده می­ شود.
۳- هیپو کلریت کلسیم: این ماده به صورت پودر است و می­توان آن را به خوبی در آب معمولی حل کرد و محلولی شفاف به دست آورد (اغلب صاف می­ شود). هیپوکلریت کلسیم نسبت به هیپوکلریت سدیم، آهسته­تر وارد بافت­های گیاهی می­ شود.
۴- کلرید جیوه: این ماده برای گیاه ، انسان و دام خیلی سمی است و غلظت ۰۱/۰ تا ۰۵/۰ درصد برای مدت ۲ تا ۱۲ دقیقه برای ضد عفونی به کار می­رود.
۱-۲۳- استفاده از آنتی بیوتیک­ها در رفع آلودگی­های درون بافتی
آلودگی­های داخلی در کشت درون شیشه ­ای درختان یکی از مشکلات بسیار جدی بوده و اغلب به علت وجود میکرو ارگانیسم­هایی اتفاق می­افتد که در داخل گیاه هستند و نمی­ توان آن­ها را از طریق مواد ضد عفونی کننده خارجی از بین برد. اگر منشا آلودگی در داخل بافت­های گیاهی باشد، آلودگی معمولا هنگامی ظاهر می­ شود که محل آلودگی قطع شده و در هنگام واکشت امکان باز شدن و تماس با محیط کشت فراهم می­ شود. اغلب آلودگی­های داخلی بعد از چند واکشت آشکار می­شوند. رشد ضعیف و یا نکروزه شدن بافت­ها، می ­تواند نشانه یک نوع آلودگی داخلی، مثلا به باکتری باشد به طور کلی دو راه برای مبارزه با این مسئله وجود دارد: (باقری و صفاری، ۱۳۷۶ و ذوالفقاری نسب، ۱۳۸۲).
۱- کشت مریستم (چون سلول های ناحیه مریستم عاری از عوامل بیماریزا هستند)
۲- اضافه کردن آنتی بیوتیک به محیط کشت
اغلب پاتوژن­هایی که برای گیاه مادری خطری ندارند وقتی در محیط کشت درون شیشه ­ای قرار می­گیرند، باعث ایجاد خسارت جدید و از بین رفتن مواد گیاهی می­شوند. در رفع آلودگی­های داخلی گاهی استفاده از آنتی­بیوتیک­ها مهمترین راهکار می­باشد. اتوکلاو کردن آنتی­بیوتیک و یا اضافه کردن آن در دمای بالا به محیط کشت باعث کاهش اثر آنتی­بیوتیک می­ شود (الیویرا و همکاران، ۲۰۱۰(^[۳۸].
۱-۲۴- ضد عفونی محیط کشت
در بیشتر موارد محیط­های کشت با بهره گرفتن از اتو کلاو استریل می­شوند و استریل در اتو کلاو توسط بخار آب انجام می­ شود. با قرار دادن اشیا یا مواد در معرض بخار تحت فشار در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد و در مدت ۱۰ تا ۳۰ دقیقه کلیه میکروارگانیسم­ها از بین می­روند. موادی که امکان استریل خشک آن­ها وجود دارد (مثل لوله­های آزمایش، فلاسک­ها، پتری­دیش­های خالی ، کاغذ و ابزارکار) به مدت ۲ تا ۳ ساعت در دمای ۱۸۰ درجه سانتی ­گراد به صورت خشک در آون استریل می­شوند. برای استریل موادی که در ضمن اتو کلاو کردن به دلیل حساسیت به گرما ، خاصیت خود را از دست می­ دهند ، از فیلترهای غشایی استفاده می شود که از جنس استات سلولز یا نیترات سلولز ، با منافذی به قطر ۲۲/۰ تا ۴۵/۰ میکرون بوده و با به کار بردن آن­ها، میکروارگانیسم­هایی که بزرگتر از قطر منافذ هستند، حذف می­شوند (باقری و صفاری ۱۳۷۶ ؛ امین و همکاران ۲۰۰۹ ).
۱-۲۵- قهوه­ای شدن بافت­های گیاهی
قهوه­ای شدن بافت­های گیاهی و در نتیجه آن محیط کشت، از جمله مشکلاتی است که در اغلب کشت­های تک جوانه­ای در درختان میوه دیده می­ شود. این پدیده ارتباط با نوع رقم گونه گیاهی دارد و میزان قهوه­ای شدن در یک رقم، در فصول مختلف و بسته به سن گیاه مادری می ­تواند متفاوت باشد. قهوه­ای شدن اغلب در گونه­ های گیاهی که دارای مقدار زیادی تانن و یا دیگر انواع هیدروکسی فنل­ها هستند، رخ می­دهد. ایجاد زخم در اثر جدا کردن بافت­ها باعث ایجاد پلی فنل اکسیداز می­ شود که این عامل اصلی اکسیداسیون ترکیبات فنلی است. آزاد شدن مواد فنلی موجب قهوه­ای شدن ریز نمونه و محیط کشت شده و باعث توقف رشد ریز نمونه­ها و یا مرگ آن­ها می­ شود. این قهوه­ای شدن بافت­ها یک پدیده خود کاتالیزوری است. بطوری­که ترکیبات فنلی آزاد شده باعث صدمه به بافت شده که این عمل باعث افزایش آزاد شدن ترکیبات فنلی می­شوند (ایزد پناه، ۱۳۸۰ ؛ سیدهو^[۳۹]، ۲۰۱۰).
قهوه­ای شدن و نکروزه شدن در ریز نمونه­ها ارتباط معنی داری با روش­های ضد عفونی دارد. نمونه­های برگ­ دار به خاطر حساسیت زیاد به غلظت­های بالاتر مواد ضدعفونی، بیشتر از نمونه­های بدون برگ قهوه­ای و نکروزه می­شوند. در این میان دو ماده کلرید جیوه و نیترات نقره از بقیه مواد قوی­تر می­باشند چرا که هر دو از فلزات سنگین بوده و دارای قدرت بالایی در واکنش با پروتئین دارند که سبب تقویت متابولیسم سلولی می شوند. در حالی که هیپو کلرید سدیم و کلسیم به خاطر درجه فعالیت کمتر، میزان خسارت وارد شده به ریز نمونه­ها در آن کمتر است. البته غلظت­های بالای این دو ماده نیز می­توانند باعث قهوه­ای شدن و نکروزه در ریز نمونه­ها شوند ) کمالی، ۱۳۷۸).
میری و همکاران (۱۳۸۲) در مطالعه­ ای که بر روی بررسی کاهش اکسیداسیون فنلی و پرآوری پایه­ های پا کوتاه سیب انجام دادند، پیشنهاد کردند که نمونه­های تازه کشت شده به مدت ۶ روز در یخچال نگهداری شوند که این کار در جلوگیری از فنلی شدن بسیار موثر بود. در مرحله پر آوری ترکیب ۲ip با کینتین نیز بهتر از بقیه تیمارها جواب داد:
راه حل­هایی که برای کاهش فنلی شدن می­توان ارائه داد شامل :
-گرفتن ریز نمونه در زمان­های خاص که میزان ترکیبات فنلی حداقل باشد.
- در مورد سن ریز نمونه، ریز نمونه­های حاصل از گیاهان نونهال کمتر از گیاهان بالغ قهوه­ای می­شوند.
-قرار دادن ریز نمونه­ها در آب مقطر به مدت ۳ ساعت قبل از کشت باعث کاهش مواد فنلی می­شوند.
- استفاده از تیمارهای ضد اکسیداسیونی
- تکرار واکشت­ها در فاصله زمانی کوتاه باعث جلوگیری از انتقال مواد فنلی به سلول­های سالم می­ شود. حذف بخش­های قهوه­ای و یا تجدید محیط کشت باعث کاهش تجمع مواد فنلی می­شوند که علاوه بر سمیت به دلیل خاصیت خود کاتالیزوری باعث ترشح بیشتر مواد فنلی می­شوند (کمالی، ۱۳۷۴ ؛ میری و همکاران، ۱۳۸۲).
ذوالفقار نسب (۱۳۸۲) با بررسی بر روی کلروزه و نکروزه شدن بافت­ها نشان داد که نوع محیط کشت عامل مهمی در ایجاد نکروزه شدن و کلروزه شدن است. عواملی مثل رشد سریع گیاهچه­ها در محیطی مثل MS به دلیل وجود مقادیر زیادی از نیترات، تماس نوک برگ­ها با دیواره ظروف کشت ، تجمع رطوبت به صورت قطره در انتهای برخی از برگ­ها و واکشت کردن با فواصل طولانی و در نتیجه کمبود برخی عناصر غذایی از جمله عوامل موثر در کلروزه و نکروزه شدن انتهای برگ­ها است. این در حالی است که در محیط WPM این مشکلات کمتر دیده شده است. کلسیم به عنوان عنصر مهمی در دیواره سلولی از تحرک کمتری در بافت­های گیاهی برخوردار است و حرکت آن تابع تعرق گیاه است. در شرایط درون شیشه ­ای ، وقتی میزان رطوبت بالا باشد به علت تعرق کم ، جذب کلسیم پایین می ­آید و در نتیجه قهوه­ای شدن و مرده شدن بافت­ها به علت تخریب سلول­ها اتفاق می­افتد.(حسین و همکاران^[۴۰]، ۲۰۰۳)
۱-۲۶- روش­های ریزازدیادی
ریزازدیادی عبارت است از تکثیر درون شیشه ­ای گیاه با بهره گرفتن از اندام­ها، بافت­ها، سلول­ها، پروتوپلاسم و غیره. اگر چه برخی منابع بیان داشته اند که جهت ریزازدیادی می­توان از تکنیک­های کشت جوانه، نوک ریشه، برگ­ها، رویان، پرچم و حتی سلول استفاده کرد ولی شناخته­ شده­ترین معنی ریزازدیادی کشت جوانه­های منفرد و شاخساره می­باشد. از این رو معمولاً کشت شاخساره و ریزازدیادی مترادف هم بکاربرده می­ شود. کشت نوک شاخساره بطور وسیعی در کشاورزی، باغبانی و جنگل کاری استفاده می­ شود. (شریفی و همکاران، ۱۳۸۸). در این تحقیق با توجه به اینکه روش جنین­زایی غیرجنسی و کشت جوانه انتخاب شده است به توضیح آن­ها خواهیم پرداخت:
۱-۲۷- جنین زایی غیر جنسی