۱۲- به مدت ۱ دقیقه میکروتیوب را در ۰۰۰/۱۵ دور سانتریفیوژ کرده تا تمامی ترکیبات جامد ته نشین شود . اینک محلول رویی حاوی DNA تخلیص شده است.
۳-۵-۲ لایگیشن
برای اتصال DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM استخراج شده از ژل، با پلاسمید بیانی pet-28a در آزمایشگاه از آنزیم لیگاز^[۵۱] استفاده می شود که می تواند اتصالات فسفودی استری شکسته شده را ترمیم کند. این آنزیم از فاژ T4 استخراج شده است و انرژی لازم برای فعالیت خود را از ATP تامین می کند و می تواند هم انتهاهای صاف و هم چسبنده را به هم متصل کند.

روش انجام این عمل به شکل زیر است:
۱- محتویات واکنش را بصورت زیر مخلوط می کنیم.
بافر لایگیشن x 10 : 3 میکرولیتر
آب استریل: ۹ میکرولیتر
DNA لیگاز T4 : 1 میکرولیتر
پلاسمید Pet-28a : 2 میکرولیتر
Insert (DNA ناحیهC2 پروتئینALCAM) : 15 میکرولیتر
حجم نهایی: ۳۰ میکرولیتر
نکته : در آخرین مرحله آنزیم T4، DNA لیگاز اضافه شود. چون اگر بعد از اضافه کردن آنزیم T4 ، محلول برای مدت طولانی در محیط بماند با توجه به قدرت بالای اتصال T4 اتصال های که مورد نظر ما نیست اتفاق خواهد افتاد.
۲- به کمک دستگاه ترموسایکلر میکروتیوب حاوی مخلوط واکنش را به مدت ۴ ساعت در ۱۶ درجه سانتیگراد سپس به مدت یک شب در دمای ۴ درجه سانتیگراد قرار می دهیم .
۳-۵-۳ ترانسفورماسیون
برای این مرحله از سویه E.coli BL21(DE3) که یکی از رایج ترین سویه های کلونینگ است استفاده می کنیم . این باکتری به تنهایی حساس به کانامایسین است ولی وقتی وکتور pet-28a را جذب می کند نسبت به آنتی بیوتیک مقاوم شده و بر روی آگار حاوی کانامایسین رشد، و تشکیل کلونی می دهد .
۳-۵-۳-۱ آماده سازی سلول های شایسته
۱- باکتری در محیط کشت فاقد کانامایسین کشت داده شد.
۲- پس از ۲۴ ساعت نگهداری در انکوباتور ، یک تک کلونی را برداشته و به ۵ میلی لیتر محیط LB مایع بدون کانامایسین تلقیح می کنیم و سپس به مدت یک شب تا صبح(over night) در شکیرانکوباتور قرار می دهیم تا باکتری رشد کنند.
۳- ۴۰۰ میکرولیتر از محیط فوق را به ۵ میلی لیتر محیط LB مایع تازه تلقیح نموده و مجددا در شیکرانکوباتور قرار می دهیم . ۲ تا ۳ ساعت بعد محیط کدورت مناسب یعنی جذب ۵/۰ تا ۸/۰ در۵۰۰ نانومتر را به ما می دهد.در این حالت باکتری ها در مرحله فاز رشد لگاریتمی قرار دارد.
۴- باکتری هایی که تازه شده و در فاز لگاریتمی تکثیر می باشند را در چند میکروتیوب استریل تقسیم کرده و ۵ الی ۱۰ دقیقه روی یخ نگه می داریم .
۵- میکروتیوب ها را ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم.
۶- مایع روئی را دور ریخته و رسوب باکتری را در یک میلی لیتر محلول استریل ۱/۰ مولار کلرید کلسیم حل می کنیم .
۷- ۲۰ تا ۳۰ دقیقه محلول مذکور را روی یخ انکوبه می کنیم .
۸٫سپس محلول را به مدت ۳ دقیقه در۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم. و محلول روی را دور ریخته
۹- این بار رسوب را در ۶۰۰ میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل ۱/۰ مولار حل می کنیم .
۱۰- ۲۰ تا ۳۰ دقیقه محلول را روی یخ انکوبه می کنیم.
۱۱- سپس محلول را به مدت ۳ دقیقه در۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم. و محلول روی را دور ریخته
۱۲- رسوب را در ۳۰۰ میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل حل میکنیم.
۱۳- به مدت ۲۰ دقیقه محلول را بر روی یخ قرار می دهیم.
این باکتری ها را می توان برای مدت ۷۲ ساعت روی یخ در یخچال نگهداری کرد و همچنین می توان با افزودن گلیسرول استریل ۳۰ درصد آن ها را در ۷۰- درجه سانتیگراد به مدت چند ماه نگهداری کرد .
۳-۵-۳-۲ ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن به روش شوک حرارتی
۱- ابتدا ۱۰۰ میکرولیتر از سلول های مستعد E.coli BL21(DE3) را روی یخ ذوب می کنیم.
۲- ۳۰ میکرولیتر از محصول لایگیشن را به ۱۰۰ میکرولیتر از سلول های مستعد اضافه می کنیم به طوری که کاملا با هم مخلوط شوند.
۳- این مخلوط را به مدت ۳۰ دقیقه بر روی یخ انکوبه می کنیم.
۴- نمونه ها را به مدت ۹۰ ثانیه در بن ماری ۴۲ درجه سانتیگراد قرار می دهیم و بلافاصله به مدت ۵ دقیقه روی یخ قرار می دهیم، بدون حرکت و کاملا ثابت.
۵- مخلوط فوق را به ۹۰۰ میکرولیتر از محیط LB مایع فاقد کانامایسین افزوده و آن را به مدت ۵/۱ ساعت در شیکر انکوباتور ۳۷ درجه قرار می دهیم تا باکتری های ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثیر نمایند.
۶- مخلوط فوق را به مدت ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم .
۷- ۸۰۰ میکرولیتر از مایع روئی را دور ریخته و رسوب را در ۲۳۰ میکرولیتر باقی مانده، به خوبی حل می کنیم .
۸- ۲۳۰ میکرولیتر را روی یک پلیت حاوی LB آگار کانامایسین دار ریخته و کشت سه قسمتی می دهیم ، اجازه می دهیم کاملا جذب محیط شده و سپس آن ها را به مدت ۱۸ تا ۲۰ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه نگهداری می کنیم .
۳-۵-۴ ارزیابی کلونی ها
پس از مدت۱۸ تا ۲۰ ساعت در انکوباتور باکتری BL21 بر روی محیط کشت تشکیل کلونی می دهد. یک تک کلونی را جدا کرده و در ۵ میلی لیتر محیط LB براث کانامایسین دار تلقیح می نمائیم و به مدت
یک شب در ۳۷ درجه و با سرعت مناسب در شیکر انکوباتور قرار می دهیم. با رشد باکتری در این محیط تایید می شود که باکتری Bl21(DE3) ، پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ما را دریافت کرده است.
۳-۵-۵ استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ناحیه C2 پروتئیین ALCAM
جهت تایید وجود پلاسمید pet-28a در باکتری و عدم وجود هرگونه آلودگی در محیط کشت نیاز است که وجود پلاسمید مورد نظر تایید شود، بدین منظور از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3) استخراج پلاسمید صورت گرفت.
۱- از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده که به مدت یک شبانه روز در دمای ۳۷ درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، ۵/۱ میلی لیتر جدا کرده و داخل میکروتیوب ۵/۱ می ریزیم.
۲- سپس به مدت ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم .
۳- محیط روئی را دور ریخته و باکتری در ته میکروتیوب رسوب می کند .
نکته:
برای استخراج غلظت بالاتری از پلاسمید می توان مراحل قبل را تکرار کرد.